操作流程:

收集基因信息——>設(shè)計(jì)引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實(shí)物保存。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

10×PCR buffer

5 μl     dNTP mix （2mM）

4 μl     引物1（10pM）

2 μl     引物2（10pM）

2 μl     Taq酶 （2U/μl）

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）

1 μl      加ddH2O至 50 μl

產(chǎn)品特點(diǎn)：

◇高特異性：與其他病毒無交叉反應(yīng)，無非特異性擴(kuò)增；

◇高靈敏度：檢測靈敏度可達(dá)10~100拷貝；

◇操作簡便：該系列所有試劑均采用相同的體系和條件，可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)檢測；

◇高通量：多種雙重PCR檢測以及三重PCR檢測試劑盒。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性定量方法，已得到的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法：

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測

;純品型;標(biāo)準(zhǔn)品;有證書 規(guī)格： 0.1g

484-12-8蛇床子 規(guī)格： HPLC≥98%；20mg/vial

洛星 規(guī)格： 100mg

607-91-0豆蔻 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg

604-80-8仙 規(guī)格： 10mg

梔子 對照品 規(guī)格： 1g

38647-10-8乙 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg

52659-56-0奇任 規(guī)格： 20mg

紅鐮-6-O-β-龍膽二糖; 規(guī)格： 20mg

70553-76-3蝙蝠葛蘇林 規(guī)格： 20mg

地中海貧血基因提取試劑盒價(jià)格E2F6  轉(zhuǎn)錄因子E2F6抗體 規(guī)格: 0.1ml

GM-CSFR alpha/CD116/CSF2RA  粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體α抗體 規(guī)格: 0.2mlVHLH/Von Hippel Lindau  腦視網(wǎng)膜管瘤G7抗體（逢希伯-林道氏?。?規(guī)格: 0.2ml

Brucella  布氏桿菌菌體抗體 規(guī)格: 0.2mlMSH3  錯(cuò)配修復(fù)3抗體 規(guī)格: 0.2ml

ICAM-3/CD50  細(xì)胞間粘附分子-3抗體 規(guī)格: 0.1ml

Piwil2/Mili  piwi樣2抗體 規(guī)格: 0.2mlphospho-NFKB p65(Thr505)  磷化細(xì)胞核因子抗體 規(guī)格: 0.1ml

Goat Anti-human IgG/Alexa Fluor 350  Alexa Fluor 350標(biāo)記的羊抗人IgG 規(guī)格: 0.1ml

HCF2/Heparin Cofactor II  肝輔助因子II抗體 規(guī)格: 0.2mlphospho-ATG4D(Ser15)  磷化自噬相關(guān)4D抗體 規(guī)格: 0.1ml

Oct-2  胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵2抗體 規(guī)格: 0.1mlNFAM1/CNAIP  NFAM1抗體 規(guī)格: 0.2ml

Goat Anti-rat IgG/Cy5  Cy5標(biāo)記的羊抗大鼠IgG 規(guī)格: 0.1ml

Slc26a5  感覺神經(jīng)性耳聾常染色體隱性遺傳61抗體 規(guī)格: 0.2ml

Activated protein C/PROC1  活化C抗體 規(guī)格: 0.1ml

使用方法:

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，*用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 陽性對照（濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

8. 如果有 N 個(gè)樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽性對照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對照管。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個(gè)用于PCR 陽性對照。